Примечание: Жизнеспособных тканей обнаруживается через флуоресценции Флуорексон Полианионная краситель. Измерение поглощения каждой скважины на Нм ссылка: Нм с использованием Считыватель микропланшетов. С нынешнего метода исследования человеческие PCLS были подготовлены и воздействию концентраций пяти промышленных веществ оценить химически индуцированных иммуномодулирующие эффекты в человеческих легких материалов. Увеличение или уменьшение цифрового смещение для настройки фона, таким образом, что он отображается синим цветом в live-образ с активированного канала цвета блокировки таблицы. Важно отметить здесь, что ожидаемое увеличение активности ЛДГ в клеточной культуре супернатанта часто влиянием прикладного вещество Тщательно накапайте мкл рабочего реагента в каждой скважине, избегая пузырьков воздуха. Положительные эталонные вещества, стиральный порошок для цитотоксичности и LPS врожденной цитокинового ответа, были использованы для проверки каждого прогона. Таким образом результаты, представленные здесь носят предварительный характер, несмотря на то, что они показывают потенциал человеческого PCLS как ценный инструмент в дыхательных исследований. Рисунок 1 : Процедура для наполнителя легкое человека. Для луночных пластина использовать мкл Реагента B и 20 мкл Реагента а.
Ганновер Медицинская школа; номер ). Письменного Установите руку скорость и скорость вращения ножей 6 на срез ткани. Скорость окисления митохондрия-. TISSUE SPECIFIC PECULIARITIES OF VIBRATION условиях при комнатной температуре 18–20 °C. Каждые 20 мин отбирали пробы для.
После инкубации PCLS с или без агентов тестирования взять 50 мкл супернатант из шага 1. Это основной протокол и технику для подготовки разделов ткани легкое человека сопоставима с методами, которые были хорошо описана в публикации Материал человека потенциально инфекционными. В предыдущих публикациях агарозы сообщать быть вымываются и удалены во время интенсивной стирки шаги после подготовки. Взвесить 12,5 мг HClPt и 34,4 мг SLS и подготовить акций решения путем растворять химических веществ в 1 мл питательной среды. Перед заправкой шприц с среднего, зажим закрыл катетер с пальцами или зажим, чтобы избежать воздушных пузырей и рефлюкс агарозы. Please follow the link in the email to activate your free trial account.
Вырежьте человека легочной ткани в см плит с острым ножом. Please enter your email address so we may send you a link to reset your password. Шкала индикатора указывают мкм A и 50 мкм E B — , соответственно. Get cutting-edge science videos from J o VE sent straight to your inbox every month. Некоторые улучшения в технике, культивирования и проверки конечных точек позволяют использовать человека PCLS в поступательного науки. Часто вмешательства происходят между существа деятельности ферментов, приводит к неправильной интерпретации результатов если ЛДГ assay был единственным цитотоксичность assay используется. Предупреждение: Формальдегид токсичных, выполнить этот шаг под капотом. Please follow the link in the email to activate your free trial account. Общая подготовка человека PCLS и последующего воздействия химических веществ. Допускаются периодов хранения около 2 ч при комнатной температуре RT до заполнения его с агарозы на льду. Остановить реакции, добавляя 50 мкл стоп раствор 1 М H 2 т- 4. Дополнительный рисунок 2: обзор анализа вычислительных изображений окрашивание микроскопических жизнеспособности человека легочной ткани. Это основной протокол и технику для подготовки разделов ткани легкое человека сопоставима с методами, которые были хорошо описана в публикации Лизатов ткани из шага 9. Измерение поглощения каждой скважины на нм, используя Считыватель микропланшетов.
Ткань является жизнеспособным и клетки реагируют на несколько раздражителей. Лечение пациентов, например, глюкокортикоидов, может также повлиять на исход экспериментов с использованием тканей человека. Дальнейшие модификации протокола главным образом зависит от применяемых химических веществ и конечные точки интереса. Общий объем сумма будет использоваться для дальнейшего анализа дополнительная цифра 1F, G. Процедура занимает мин. Нажмите на вкладку Z-стек под многомерные приобретения и использовать фокус переход к z уровень интереса. Установите руку скорость и скорость вращения ножей 6 на срез ткани.
Помимо этих достижений исследований, Lauenstein et al. Стеки 30 мкм были приняты с 10 X цели A и B к просмотру. Рисунок 1 : Процедура для наполнителя легкое человека. Если ткани был сохранен на льду, предварительно нагреть его до RT перед заполнением его, в противном случае агарозы будет полимеризоваться немедленно, и не однородное заполнение будет возможно. Таким образом разбавляют образец в реагента, предоставляемый assay. Из нашего опыта и микроскопические параметры, описанные выше измеряется средний объем между 1,5 х 10 6 и 5 x 6 мкм 3 управления ткани.
Таким образом результаты, представленные здесь носят предварительный характер, несмотря на то, что они показывают потенциал человеческого PCLS как ценный инструмент в дыхательных исследований. Примечание: Разрыв в плевру предотвращает однородное заполнение ткани. Если ткани был сохранен на льду, предварительно нагреть его до RT перед заполнением его, в противном случае агарозы будет полимеризоваться немедленно, и не однородное заполнение будет возможно. Примечание: Два человека требуются для заполнения легких. Таким образом, важно, чтобы: i положительные отзывы, проверки жизнеспособности, функциональность и чувствительность отдельных тканей для проверки каждого эксперимента и ii кросс проверить результаты, используя здоровым, не больной, среднего возраста легочной ткани от лабораторных животных нечеловеческих приматов как cynomolgus и, если возможно, мышь, крысы, морских свинок. Примечание: Избегайте воздействия реагентов для прямой свет. Микроскопические оценки выполните по крайней мере два случайно распределенными z стеки с cLSM. Сильно пораженные ткани вряд ли могут быть использованы, и очень часто показывает ограниченный жизнеспособности, уровни цитокина неадекватно низкой или очень высокой, бактериальной или грибковой инфекции и меньше бронхоспазма. В настоящем документе описывается методика ex vivo человека PCLS изучить потенциал иммуномодулирующих низкой молекулярной массой вещества, такие как Гексахлороплатинат аммония HClPt. Положите легких на льду для полимеризации агарозы в гель для мин, в зависимости от количества внушал агарозы. Аккуратно дотроньтесь плевры на нескольких сторон, чтобы проверить, является ли это жесткий и прохладный, означающее что полимеризации является полным, в противном случае продолжать ждать. Примечание: Все дальнейшие шаги выполняются в стерильных условиях. Вычесть поглощения в Нм от Нм.
Однако прогресс в использовании PCLS со всеми их преимуществами над одной-клеток вносит ценный вклад в том смысле, что этот метод может использоваться для высокопроизводительного скрининга, как описано в Watson et al. Для этой цели добавьте 1 мкл Флуорексон-ам 4 мм и 2 мкл EthD-1 2 мм мкл питательной среды. Чем лучше оценка патологии пораженной ткани, тем лучше экспериментальных результатов. Дополнительный рисунок 1: подробные вычислительной обработки изображений микроскопических окрашивание с помощью рендеринга программного обеспечения жизнеспособности. После нескольких шагов Стиральная PCLS передаются в плиты культуры клеток например , ну пластина с двумя PCLS на хорошо и мкл среднего для удаления остатков клеток мусора и выпустила клеточных медиаторов F. Использование подходящих позитивных элемента управления, например LPS, демонстрирует действенность метода. Реконструировать красный канал пятна для мертвых клеточных ядер. Удаление образцов и пипетки мкл Отмывающий буфер в каждой скважине.
Регистрация новых HMW или LMW химических веществ требует оценки рисков в пробирке и в естественных условиях относительно их предполагаемого информирование потенциальных например. В зависимости от чувствительности анализа и на выпущенных цитокина образцы должны быть разбавлен до измерения. Нервные волокна, хотя вырезать, может быть локально активирован, ведущих к терминал рефлекторные реакции Отварите агарозы в микроволновую печь, пока растворится агарозы. Легкое человека материал должен быть обработан непосредственно после резекции для сохранения жизнеспособности тканей. Неоднородное наполнения тканей приведет к толщины различных фрагментов. В самом деле это не возможно, не могут быть удалены агарозы. Этот метод требует практика и обучение персонала.
Ткани используется для assay WST-1 см. Из нашего опыта и микроскопические параметры, описанные выше измеряется средний объем между 1,5 х 10 6 и 5 x 6 мкм 3 управления ткани. Thank You! Для легких токсичность тестирования и уменьшить количество животных в этом контексте, Гесс и др. Таким образом ограничена возможность получить механистический понимание ответы одноклеточных и функциональность. Это позволяет внутреннего контроля, а также различные концентрации или наркотики испытанию.
Примечание: Этот шаг светочувствительной. Таким образом результаты, представленные здесь носят предварительный характер, несмотря на то, что они показывают потенциал человеческого PCLS как ценный инструмент в дыхательных исследований. Ткань является жизнеспособным и клетки реагируют на несколько раздражителей. Please enter an institutional email address. Continue Learn more Close. Подтверждения целостности мочку легкое человека.
Реакции ткани была хорошо описана для первого до 48 h в экспериментах острого воздействия. С другой стороны используемые стимул может быть относительно слабой. Вместо измерения и стандартизации Толщина ломтика, измерение содержания общего белка может использоваться косвенно контролировать толщины срез легких. Повторите шаги 1. Однако прогресс в использовании PCLS со всеми их преимуществами над одной-клеток вносит ценный вклад в том смысле, что этот метод может использоваться для высокопроизводительного скрининга, как описано в Watson et al. Это создает дубликаты от каждого лечение хорошо из ну пластины. С тех пор применение PCLS в исследованиях расширилась от тестирования функциональных ответов, таких как сократимость 9 , 10 и вазоконстрикция 11 , иммунологические, фармакологические 12 , 13 , и токсикологические 7 тестирование различных видов в нескольких лабораториях. Остановить реакции, добавляя 50 мкл стоп раствор 1 М H 2 т- 4. Your access has now expired. Примечание: Этот диаметр должна быть эквивалентна диаметр держателя ткани внутри машины.
Нажмите на зеленую кнопку вперед. Кроме того содержание общего белка для нормализации и провоспалительных цитокинов были измерены. Если мертвые клеточных ядер преимущественно присутствуют в элементе ткани, однако, эксперимент следует отказаться. После инфляции легочной ткани и гелеобразующего агарозы на льду легкие нарезать секции толщиной микрон. Персонал лаборатории должны пройти подготовку для повышения согласованности пробирного и свести к минимуму анализа изменчивости. В этом случае количество ткани может быть увеличено с двух до 4 ломтика в колодец.
Эта процедура помогает пользователям получить практику дискриминации различных больной областях и местах в легких. Таким образом разбавляют образец в реагента, предоставляемый assay. Положите вес часть держателя ткани поверх основной ткани. Необходимость в подготовке разделов очень свежие ткани должен подчеркнуть, как жизнеспособность тканей является критическим вопросом в культуре. Никаких дальнейших смешивания требуется. Храните питательной среды на несколько дней в стерильных условиях в холодильник. Заполните чашку Петри x 15 мм с 25 мл ледяной питательной среды. Накапайте мкл рабочего разведения в каждом хорошо и инкубировать ну пластина для 45 мин на RT в темноте. Последовательность ткани является очень важным вопросом. Отрегулируйте толщину ломтиков легких к значению требуемой толщины. Применимость нерастворимых или высокой реакционной способностью химических веществ является ограниченной. Если мертвые клеточных ядер преимущественно присутствуют в элементе ткани, однако, эксперимент следует отказаться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Дальнейшие модификации протокола главным образом зависит от применяемых химических веществ и конечные точки интереса.
Приготовьте рабочий раствор путем разбавления WST-1 реагента в среде непосредственно перед началом. Проверьте все точки обозначены и каждая точка считается только один раз. Эти значения могут впоследствии использоваться для выбора концентрации цитокинов и хемокиновых уровней: в высоко токсичных концентрациях, обычно нет или только уменьшилось цитокинов и chemokines могут быть обнаружены. Примечание: Синий цвет в «живой» образ будет указано, что нет сигнала, тогда как высокий сигнал появится в белом и переэкспонированными сигнал будет отображаться красным цветом. Вычесть поглощения в Нм от Нм. Continue Learn more Close. Замените этот объем в три раза. Нажмите на Live еще раз, чтобы отключить live-образ и нажмите на Начать эксперимент , чтобы начать съемки. Растворите водорастворимые вещества непосредственно в среде культуры. В настоящем докладе дается описание этой техники и его использования для проверки токсичности веществ в легких тканей ex vivo.
тельно окрепшего после первой совместной пробы сил в «Кондоре»: П. Баум, Ф Ганновер – ,. Берлин) – видный поэт активистского крыла. От столицы Германии до нашего пункта назначения км прямой дороги без ограничения максимальной скорости. Парковка практически везде платная. На любом этапе.
ЛДГ Assay Примечание: Уровень ЛДГ генотипирования в луночных плита с мкл культуры супернатант в общей сложности после после инкубационного периода. Нервные волокна, хотя вырезать, может быть локально активирован, ведущих к терминал рефлекторные реакции Эксперименты с человеческой PCLS должны быть выполнены согласно Кодекс этики Всемирной медицинской ассоциации и утвержден Комитетом местных этики образцовой PCLS эксперименты, показанный здесь были утверждены Комитетом местных этики Ганновер Медицинская школа; номер В резюме протокол, представленные здесь для подготовки и последующего воздействия человеческого PCLS обеспечивает полезный метод для оценки потенциально легких-токсичных или иммуномодулирующих веществ, которые могут быть вовлечены в развитие респираторных заболеваний, таких как профессиональной астмы. Пусть патологоанатомов легких нарезать ломтиками, взять их образцы и хранить легких материалов на льду для транспортировки. Еще одно ограничение для некоторых конечных точек является наличие агарозы в ткани, препятствуя, например, изоляцию высокого качества и достаточного количества РНК 31 или подготовка одного клеточной суспензии для последующих проточной цитометрии и фенотипирование клеток. Замените этот объем в три раза. Ткани, которые мы используем в этом протоколе получается из пациентов, перенесших резекцию.
Не каждая часть среза изготовлена из нержавеющей стали, и поэтому он будет окисляются если не высушить немедленно изменить очистки. Пусть патологоанатомов легких нарезать ломтиками, взять их образцы и хранить легких материалов на льду для транспортировки. Респираторных заболеваний в их широкого разнообразия нужны соответствующие модели системы для понимания основополагающих механизмов и разработки новых терапии. Примечание: Компьютер рекомендации программного рендеринга изображения должны учитываться, как эта программа требует соответствующего оборудования. Рекомендуется использовать запись современных вакцинации для гепатита A и B. Для луночных пластина использовать мкл Реагента B и 20 мкл Реагента а.
Пробы Экстази, скорость Ганновер После первого введения агар заполнены человеческих легких ломтики в году Fisher et al. Даже несмотря на то, что за последние десятилетия существенно оптимизирована методика PCLS, ее применимости для тестирования иммуномодуляция находится все еще в разработке. Отварите агарозы в микроволновую печь, пока растворится агарозы. Разоблачить легочной ткани веществ см. Общий объем сумма будет использоваться для дальнейшего анализа дополнительная цифра 1F, G. Таким образом эти критерии приемлемости, Опубликовано Гесс и др.
Пользовательское соглашение Политика конфиденциальности. Для этой цели добавьте 1 мкл Флуорексон-ам 4 мм и 2 мкл EthD-1 2 мм мкл питательной среды. Без дальнейшего разъединения ломтики заказ, как только нехватка достаточно свежей среды будет стимулировать клеточную смерть в срезах ткани. Человеческого PCLS культивировали в условиях нормальной клеточной культуры и воздействию, например, химических веществ, наркотиков или липополисахаридов. Для преодоления проблем оборудования, это может быть необходимо иметь по крайней мере одно устройство резервного копирования. Реконструировать красный канал пятна для мертвых клеточных ядер. Подготовьте окончательный разбавления 1: в подогретым среде. Калибровочной кривой должны следовать кривой сигмоид доза ответ. Бронхи канюлированной с гибкой силиконовые трубки и исправлена зажимы C. Качество материала легкое человека, основанный на фоне болезни, имеет решающее значение здесь. Вырежьте человека легочной ткани в см плит с острым ножом. Перевод PCLS на встраивание формы. Он содержит, например, жилой альвеол и бронхиальной эпителиальных клеток, гладких мышечных клеток, фибробластов, эндотелиальные клетки, нервных волокон и макрофагов. Таким образом эти критерии приемлемости, Опубликовано Гесс и др.
Респираторных заболеваний в их широкого разнообразия нужны соответствующие модели системы для понимания основополагающих механизмов и разработки новых терапии. Основным преимуществом человеческого PCLS, по сравнению с другими 3D модели является наличие иммунных клеток и нервных волокон. Основываясь на доза реакция кривых, минимальные и максимальные значения поглощения должны быть определены для анализов цитотоксичности и встретились для последующих экспериментов. Для полного удаления агарозы он должен быть повторно расплавленный при высоких температурах, которые бы уничтожить ткани. Никаких дальнейших смешивания требуется. Примечание: Синий цвет в «живой» образ будет указано, что нет сигнала, тогда как высокий сигнал появится в белом и переэкспонированными сигнал будет отображаться красным цветом. Убедитесь, что Силиконовая трубка зацикленная внутри и не может выскользнуть во время процедуры наполнения.
Процедура занимает мин. Используйте кнопку громкости для поверхности реконструкции жизнеспособных ткани Флуорексон окрашивание дополнительный Рисунок 1A и кнопку пятна для мертвых клеточных ядер дополнительная цифра 1 Ч. После инфляции легочной ткани и гелеобразующего агарозы на льду легкие нарезать секции толщиной микрон. Для анализа расчет калибровочной кривой с помощью Марквардт уравнение 4-параметр после вычитания заготовки. If you want more info regarding data storage, please contact gdpr jove. Примечание: Достоверные данные для цитотоксичность оценки могут быть получены только жизнеспособные ткани. Работа Lauenstein et al. Микроскопические оценки выполните по крайней мере два случайно распределенными z стеки с cLSM. Нажмите на подраздел каналы и установите флажок Показать все. Таким образом набор иммуномодулирующих конечных точек например , жизнеспособности и цитокина секреция был выбран для определения раздражающего или воспалительных потенциал таких химических веществ, как соединения LMW платины. Разоблачить легочной ткани веществ см. Neuhaus, V. Эта цифра была изменена от Lauenstein и др.
Таким образом рекомендуется нетоксичные или только слегка токсические концентрации IC Использование сыворотки свободных и без красителя питательной среды, как сыворотка состав меняется от партии к партии и красителей, таких как фенол красный, может мешать анализов. Человеческого PCLS техника хорошо известна в нашей лаборатории. Респираторных заболеваний, таких как аллергической астмы, профессиональной астмы, хронической обструктивной болезни легких ХОБЛ , эмфизема и инфекции верхних и нижних дыхательных путей находятся на подъеме и представляют во всем мире здоровья бремя 1 , 2. Create Account. Примечание: Клетки сетчатый фильтр предотвращает ломтики втягиваться в пипетку, чтобы избежать повреждений на ломтики. Инкубируйте на RT 1 ч. Что касается оборудования микротома могут привести к утечке и шестнадцатеричный незатянутых винтов может привести к повреждения двигателя и остановки движения лезвия. Check access. Остановить реакции, добавляя 50 мкл стоп раствор 1 М H 2 т- 4. Чем лучше оценка патологии пораженной ткани, тем лучше экспериментальных результатов.
Никаких дальнейших смешивания требуется. Если мертвые клеточных ядер преимущественно присутствуют в элементе ткани, однако, эксперимент следует отказаться. Эти значения будут использоваться для расчета в шаге 6. Используйте цикл прививка. Примечание: Клетки сетчатый фильтр предотвращает ломтики втягиваться в пипетку, чтобы избежать повреждений на ломтики. Растворите водорастворимые вещества непосредственно в среде культуры. Измерение Cytokines и Chemokines в человека PCLS Примечание: Цитокинов и хемокиновых иммунный ответ может быть измерена внеклеточно в надосадке культуры и внутриклеточно лизатов ткани после время инкубации. Стеки 30 мкм были приняты с 10 X цели A и B к просмотру. Производитель срез ткани рекомендует толщиномер их кусочек ткани для проверки толщины срез. LMW агенты имеют высокий потенциал сенсибилизация при формировании гаптенами и привязку к перевозчику белки
Такие оценки рисков обычно проводится в исследованиях на животных. После инфляции легочной ткани и гелеобразующего агарозы на льду легкие нарезать секции толщиной микрон. Эти значения будут использоваться для расчета в шаге 6. Your access has now expired. Пользовательское соглашение Политика конфиденциальности. ЛДГ Assay Примечание: Уровень ЛДГ генотипирования в луночных плита с мкл культуры супернатант в общей сложности после после инкубационного периода. PCLS отражать функциональные неоднородность со всеми типами соответствующие клетки в дыхательных путей 6.
Следовательно при высоко токсичных концентрациях содержание общего белка не может использоваться для нормализации цитокинового данных. Задать все параметры управления ткани и применить их ко всем изображениям. Please enter an institutional email address. Forgot Password? С нынешнего метода исследования человеческие PCLS были подготовлены и воздействию концентраций пяти промышленных веществ оценить химически индуцированных иммуномодулирующие эффекты в человеческих легких материалов. Выберите разделы для эксперимент, основанный на ориентацию слайдов первый и последний 8 секций обычно неполной. To learn more about our GDPR policies click here. Удаление блокирования решения и добавьте разбавленные образцов для стандартной кривой для разбавления следовать инструкциям производителя и мкл ткани супернатанта или мкл lysate в дубликаты, собранных в шаге 9. Эти качества управления также служат в качестве индикаторов недостаточно ткани жизнеспособности. Легкое человека материал имеет биологические состав, который точно отражает обычный орган архитектуры. Он содержит, например, жилой альвеол и бронхиальной эпителиальных клеток, гладких мышечных клеток, фибробластов, эндотелиальные клетки, нервных волокон и макрофагов. Есть опубликованных анализов, которые были проверены и сообщениям, были использованы для определения дыхательных сенсибилизаторов. Случайные загрязнения PCLS из-за инфекции неизвестных является Специальный выпуск в культуре человеческих легких материалов. Сложность человеческого легочной ткани поддерживает перевод результатов от животного к человеку и в пробирке в естественных условиях. Основным преимуществом человеческого PCLS, по сравнению с другими 3D модели является наличие иммунных клеток и нервных волокон.]
Аккуратно дотроньтесь плевры на нескольких сторон, чтобы проверить, является ли это жесткий и прохладный, означающее что полимеризации является полным, в противном случае продолжать ждать. Чтобы свести к минимуму эти ограничения и в контексте 3Rs замена, изысканности, сокращение принцип 5 , новые альтернативные модели постоянно развивается. Рисунок 4 : Представитель изображений трехмерных микроскопических окрашивание и изображение рендеринга человеческого PCLS. Прежде чем надувать человеческого материала, температура раствора агарозы должен быть тщательно проверены. После подготовки человека PCLS и интенсивной стирки шаги, которые необходимы для удаления мусора клеток и выпустили энзимов, ткани, разделы могут быть использованы для экспериментов Neuhaus, V. Настройка рабочего процесса между клиники и лаборатории является критическим вопросом и требует общения и определения интерфейсов и инфраструктуры между обоих сайтов. Слишком много крови или других жидкостей, экссудата внутри человека легочной ткани приведет к нежелательным разрежения агарозы и будет влиять на процесс полимеризации.